Invader®法の用語

1)       Cleavase®（クリベース®）

Flap Endonuclease 1（FEN-1）は、DNAのFlap構造を認識して部位特異的に切断する酵素である。この酵素は、古細菌からヒトまで共通に見出されるDNAの複製に必須の酵素である。Cleavaseは、超耐熱性古細菌から分離されたDouble Flap Endonucleaseの一種で（Olivier, M. 2005）、複数のCleavase®が、特許で公開されている（JP4362150B2、EP2055781B1）。
 

2)      Invader®法

 Invader法は、Double Flap構造を認識して切断するCleavaseを利用した二段階の等温反応からなる。
Ÿ   第１段階では、2種類のオリゴヌクレオチド（Invader ProbeとSignal Probe）がDNAの標的部位とハイブリダイズする。2種類のオリゴヌクレオチドが少なくとも1塩基でオーバーラップすることにより、Double Flap構造（三重鎖DNA）が形成され、その構造をCleavaseが認識してSignal Probeを切断し、5’末端のFlapを遊離させる。
Ÿ   第２段階では、第１段階で遊離したFlapが蛍光物質及び蛍光消光物質（クエンチャー、Q）に修飾された検出用のDNA基質（FRETカセット）とハイブリダイズして新たなDouble Flap構造を形成する。Cleavase®は、新たに形成されたFlap構造を認識して切断する。この時に、クリベースは、蛍光色素と蛍光消光物質の間を切断するため、蛍光色素が遊離し、蛍光を発するようになる。
Ÿ   このサイクルが繰り返されることで蛍光シグナルが増幅される。この反応は、検出される蛍光シグナルのみが増幅されるため、テンプレートDNAを増幅する必要がない。また、PCR法と組合わせて、より検出感度を高めることもできる。
 

3)       FRET 

FRETは、Fluorescent Resonance Energy Transferの略で、蛍光を発する分子同士（ドナーとアクセプター）の間でエネルギーのやり取りが起こる現象のことである。アクセプター分子が受け取ったエネルギーを熱エネルギーとして放出するときは、蛍光が消光するので、このようなアクセプターは、クエンチャー（Q）と呼ばれる。FRETは、ドナーとアクセプター分子が充分に近接（1.0-10 nmに存在）しているときに起こる。Invader法で使われるFRETカセットは、励起光を受け取った蛍光分子に対して、クエンチャー（Q）の影響により消光（蛍光クエンチング）されているDNAオリゴマーである。FRETカセットの蛍光クエンチングは、Cleavaseによる切断により解除され、蛍光分子が蛍光を発するようになる。
 

4)       FRETカセット

Invader法で使われるFRETカセットは特異なヘアピン構造を持つDNAオリゴマーで、ステムループ（ヘアピン）構造になっており、ステムの部分は2重鎖となっている。